miRNA提取分离试剂盒

产品货号：

WH0129

中文名称：

miRNA提取分离试剂盒

英文名称：

miRsmart miRNA Isolation Kit

产品规格：

50次

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1～3天

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本试剂盒是基于吸附柱法开发的miRNA提取分离试剂盒，能高效的提取长度为20～200nt的miRNA、siRNA、snRNA等小片段RNA，同时也能进行总RNA的提取。高效的裂解液能轻松裂解各种组织，细胞等。吸附柱采用特殊的硅基质膜填料，大大增强了其对RNA的吸附能力，尤其是small RNA（＜ 200nt)。1h内即可完成所有操作，提取的RNA没有DNA和蛋白污染，提取物可用于Northern blot analysis，Quantitative,real-time RT-PCR，Microarray analysis。

本试剂盒适用于细胞、动物组织、植物组织、血清、血浆等样本中RNA的提取，每个吸附柱每次可处理30～50mg动物组织(RNA含量高的组织，如肝脏不能超过30mg)，100mg植物组织或1×10⁷细胞。

产品特点：

能准确分离20～200nt的小RNA片段。
功能全面，除了小片段的提取，还能进行总RNA提取。
操作简便，一个小时内即可完成所有操作。
纯度高，提取的RNA没有DNA和蛋白污染，方便进行下游实验的分析。

提取实例：

使用本试剂盒提取30mg小鼠肝脏的miRNA Ct值比传统异丙醇沉淀方法提取的miRNA Ct值更小。

动物/植物miRNA提取分离试剂盒提取实例

使用本试剂盒提取30mg小鼠肝脏样本的miRNA吸收峰曲线图，此图可以证明本试剂盒提取的miRNA比传统的异丙醇沉淀方法提取的miRNA纯度更高。

试剂盒组成：

组分	规格
裂解液MZ	60mL
漂洗液RW	12mL
去蛋白液MRD	12mL
RNase-Free ddH2O	15mL
RNase-Free吸附柱miRspin（含2mL收集管)	50套
RNase-Free吸附柱miRelute（含2mL收集管)	50套
RNase-Free离心管（1.5mL)	50个

储存条件：室温（15～25℃)，裂解液MZ应在2～8℃避光保存。

预防RNase污染，应注意以下几方面：

经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
RNA在裂解液中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1% （v/v)，放置过夜，高压灭菌)。

操作步骤：
第一次使用前应在漂洗液RW和去蛋白液MRD中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。

一、组织或细胞中miRNA富集部分的提取
对miRNA的纯度要求较高时，比如在研究miRNA芯片、miRNA克隆时建议采用此方法。

样品处理
- 组织：将组织在液氮中磨碎。每30～50mg动物组织或者100mg植物组织加1mL裂解液MZ，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液MZ体积的十分之一。
- 单层培养细胞：直接在培养板中加入裂解液MZ裂解细胞，每10cm2面积加1mL MZ。用取样器抽打几次。
  注意：裂解液MZ的加入量根据培养瓶面积决定，不是由细胞数决定。如果加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。
- 细胞悬液：离心2100rpm（400×g）5min取细胞，弃上清。加入1mL裂解液MZ，振荡器振荡或移液器吸打数次混匀。加裂解液MZ前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
将匀浆样品在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
可选步骤：4℃ 12000rpm （~13400×g)离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。
注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可加此步骤离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清溶液中。
加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min。
4℃ 12000rpm （~13400×g)离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液MZ试剂的50%。把水相转移到新管中，进行下一步操作。
量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积0.43倍的无水乙醇（如：500μL的转移液加215μL无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入向吸附柱miRspin中，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入向吸附柱miRspin中，请分两次转入，离心后弃掉向吸附柱miRspin，保留流出液。
量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积0.75倍的无水乙醇（如：700μL的流出液加525μL无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute中，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱miRelute中，请分两次转入，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。
向吸附柱miRelute中加入500μL去蛋白液MRD（请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，弃废液。
向吸附柱miRelute中加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，弃废液。
重复操作步骤9。
将吸附柱miRelute放入2mL收集管中，室温12000rpm （~13400×g)离心1min，去除残余液体。
注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱miRelute在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。
将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free 1.5mL离心管中，加15～30μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心2min。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于15μL，体积过小影响回收效率。且RNA应保存在-70℃，以防降解。注意：如果想提高RNA得率，可重复上步操作一次。

二、组织或细胞中Total RNA的提取
对miRNA的纯度要求不高时，比如在研究miRNA RT-PCR、miRNA Northern blot时也可以采用此方法。

样品处理（同一、组织或细胞中miRNA富集部分的提取步骤-1)
同组织或细胞中miRNA富集部分的提取步骤-2
同组织或细胞中miRNA富集部分的提取步骤-3
同组织或细胞中miRNA富集部分的提取步骤-4
同组织或细胞中miRNA富集部分的提取步骤-5
量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积1.5倍的无水乙醇（如：500μL的转移液加750μL无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin中，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱miRspin，请分两次转入，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRspin。
向吸附柱miRspin中加入500μL去蛋白液MRD（请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，弃废液。
向吸附柱miRspin中加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，弃废液。
重复操作步骤8。
将吸附柱miRspin放入2mL收集管中，室温12000rpm （~13400×g)离心1min，去除残余液体。
注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱miRspin在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。
将吸附柱miRspin转入一个新的RNase-Free 1.5mL离心管中，加30～100μL RNase-FreeddH2O，室温放置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心2min。洗脱缓冲液体积不应少于30μL，体积过小影响回收效率。且RNA应保存在-70℃，以防降解。
注意：如果想提高RNA得率，可重复上步操作一次。

三、全血、血清或血浆中miRNA富集部分的提取

样品处理：每200μL全血、血清或血浆中加入等体积裂解液MZ，振荡器振荡混匀30sec。
室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
室温12000rpm （~13400×g)离心10min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。
加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min。
室温12000rpm （~13400×g)离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇（如：300μL的转移液加100μL无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin，室温放置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液。
量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇（如：300μL的流出液加200μL无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。
向吸附柱miRelute中加入500μL去蛋白液MRD（请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，弃废液。
向吸附柱miRelute中加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，弃废液。
重复操作步骤9。
将吸附柱miRelute放入2mL收集管中，室温12000rpm （~13400×g)离心1min，去除残余液体。
注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱miRelute在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。
将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free 1.5mL离心管中，加15～30μL RNase-FreeddH2O，室温放置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心2min。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于15μL，体积过小影响回收效率。且RNA应保存在-70℃，以防降解。如果想提高RNA得率，可重复上步操作一次；或者增加血清或血浆的样品量并成比例增加裂解液和氯仿的用量。

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